| Е.М. Булатова, Н.М. Богданова
ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Росздрава»
(ректор – проф. В.В. Леванович), Санкт-Петербург, РФ
Значение кишечной микробиоты и пробиотиков для формирования иммунного ответа и здоровья ребенка
Введение
Изучение микробной эндоэкологии человека – одно из наиболее актуальных направлений медицинской науки и практики. Интерес к изучению микробиоценоза человека обусловлен тем, что влияние многих средовых факторов, характерных для современной цивилизации, приводит к изменению в эволюционно выработанной системе взаимоотношений между организмом хозяина и его микробиотой. В настоящее время имеются доказательства того, что изменение взаимосвязи между составом кишечной микробиоты и организмом хозяина сопровождается развитием аллергических иммунопатологических состояний и ряда заболеваний, таких как синдром раздраженной кишки, различные виды рака, ожирение, воспалительные заболевания кишечника [1- 6].
Кишечный микробиоценоз и его значение для организма хозяина
Микробиота, заселяющая макроорганизм выполняет ряд жизненно важных функций по поддержанию организма хозяина в здоровом состоянии. Основа положительного влияния микробиоты на здоровье человека – ее симбиотическая взаимосвязь с макроорганизмом. Роль хозяина заключается в обеспечении микробиоты стабильной средой обитания и питательными веществами. Микробиота, в свою очередь, не только снабжает организм хозяина питательными компонентами, защищает от патогенных возбудителей, но и способствует развитию его желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), формированию и поддержанию адекватного иммунного ответа на протяжении всей жизни [7].
Плод в утробе матери находится практически в стерильных условиях, массивная его колонизация начинается при прохождении через родовые пути. Микроорганизмы, колонизировавшие биотопы младенца, стремительно размножаются и достигают к концу 1-го месяца жизни количества 1011 КОЕ/г содержимого толстой кишки. В последующие периоды жизни темп роста колоний микроорганизмов несколько замедляется и у взрослых людей в среднем составляет 1013-1015 КОЕ/г, что в 10 раз превышает численность собственных клеток макроорганизма [8].
Изучение видового состава нормальной микробиоты человека является сложной задачей, поэтому до настоящего времени точно не определено общее количество видов бактерий, населяющих ЖКТ. В научных публикациях приводятся сведения о значительном варьировании, от 400 до 1000 филотипов, что примерно соответствует количеству бактериальных видов [9-11].
Для лучшего понимания процессов микробного заселения и определения видового состава микрофлоры используются общие и специфические методы оценки микробной экологии и колонизационной резистентности: бактериологические, гистохимические, морфологические, молекулярно-генетические, комбинированные и др. [12]. Наиболее широко используемые методы оценки микробиоценоза – бактериологическое исследование кала, полимеразная цепная реакция (ПЦР), хромато-масс-спектрометрия [13], генно-молекулярный анализ с определением рибосомальной ДНК и РНК [14], и изучение микробных метаболитов (газожидкостный, ионно-обменный, жидкостный методы хроматографии) [15].
Основные представители кишечной микрофлоры человека были определены в пан-европейском исследовании, в которое вошли 91 здоровый пациент из 5 стран. При бактериологическом обследовании у всех участников выявляли три доминирующих вида микроорганизмов (без существенных видовых различий между жителями разных стран): группа бактероидов, Clostridium leptum и Clostridium coccoides/ Eubacterium rectale group [16]. Было также выделено несколько других групп микроорганизмов, включая бифидобактерии, Atopobium, лактобактерии и их родственные виды. Их количество меньше, но они также встречаются у большинства людей [17-19]. Таким образом, в настоящее время установлено 6 доминирующих и превалирующих филогенетических групп микроорганизмов. Тем не менее, примерно 25% бактерий, выделенных из универсальных проб, до сих пор не идентифицированы.
Приведенные данные не относятся к детям раннего возраста, у которых наряду с бактероидами преобладают бифидобактерии, при условии, если ребенок находится на исключительно на грудном вскармливании [16;20], а также к пожилым людям [21].
Несмотря на доминирование одних и тех же видов бактерий, у каждого человека фекальная микробиота уникальна и отличается от микробиоты другого человека.
Как показано в пилотном исследовании, при условии соблюдения постоянной диеты, кишечная микрофлора у человека достаточно стабильна и устойчива [14, 22]. Она способна восстанавливаться до начального состояния в течение 30–60 дней после стрессового воздействия – например, после антибиотикотерапии [23, 24].
Для понимания молекулярных основ влияния нормальной кишечной микрофлоры на функцию кишки необходимо знать, как поддерживается микробное сообщество и как его можно модифицировать с помощью пробиотиков для пользы макроорганиза. С этой целью используют модели гнотобиотических животных, которым искусственно контаминируют один из видов комменсальных микроорганизмов. Например, в ходе эксперимента при 10-дневной колонизации слепой кишки гнотобиотических мышей Bacteroides thetaiotaоmicron было выявлено, что симбионты изменяют функцию генома и экспрессию широкого ряда генов, влияющих на всасывание нутриентов пищи, ангиогенез слизистой оболочки кишки, метаболизм ксенобиотиков, а также на развитие врожденной иммунной системы [25–28].
Защитное влияние микробиоты на организм хозяина изучено по функциональному состоянию генома после колонизации стерильных мышей такими микроорганизмами как Listeria monocytogenes или ее непатогенным близким родственником L. innocua. Исследование показало, что контаминация L. innocua вызывает подобную экспрессию генов, как и бактерия B. thetaiotaоmicron. Колонизация макроорганизма L. monocytogenes запускает экспрессию генов, которые влияют на активность NF-?B-зависимый и интерферон-зависимый пути, а штамм-мутант L. monocytogenes, содержащий листериолизин, способен индуцировать иммунный ответ организма хозяина [29]. Учитывая эти данные, можно предположить, что наличие или отсутствие всего одного компонента гена у микроорганизма дает ему возможность достигать цитоплазматических структур клетки хозяина и существенно влиять на взаимодействие с макроорганизмом [30].
Несмотря на развитие новых методов исследования в области микробиологии и генетики, ряд вопросов требует дальнейшего активного изучения. Например, влияет ли потребление определенных ингредиентов пищи in vivo на экспрессию генов бактерий и на что влияет экспрессия определенных генов в различных частях ЖКТ? В работе R. Oozeеr и соавт. показана способность штамма L. casei инициировать синтез белка во время прохождения по ЖКТ гнотобиотических мышей [31, 32] и возможность физиологической адаптации экзогенных пробиотиков к условиям пищеварительной системы через изменение активности промоутеров [33].
Не менее важный аспект для изучения – влияние экзогенных факторов и генотипа хозяина на формирование микробиоценоза в онтогенезе. Исследование, проведенное группой ученых под руководством J.M. Otte (2004), свидетельствует о том, что микробиота однояйцевых близнецов более схожа по составу, чем микробиота людей, живущих длительно вместе (например, супругов) [34]. Из этого можно сделать вывод, что микробиота человека во многом определяется генетическим компонентом, однако его значимость изучена недостаточно.
До конца не ясен вопрос о вкладе пристеночной и полостной микрофлоры в обеспечение нормального функционирования кишки с точки зрения cross-talk-взаимодействия микрофлоры между собой и с клетками хозяина. Важность просветной микрофлоры иллюстрирует факт быстрого заживления слизистой оболочки кишки и ее защиты от послеоперационных рецидивов воспаления при болезни Крона. Необходимо четко знать, чем представлена пристеночная микрофлора, т.е. являются ли ее представители адгезирующими бактериями. Это обусловлено тем, что полостные бактерии, несмотря на легкость их выделения, не описывают истинный состав просветной микрофлоры всего ЖКТ, а определяют лишь видовой состав в толстой кишке и никак не характеризуют микрофлору, ассоциированную со слизистой кишечника [35].
Взаимодействие (cross-talk) между полостными и пристеночными микроорганизмами, а также с клетками ЖКТ хозяина многообразны и сложны. Они включают:
- конкуренцию микроорганизмов за нутриенты;
- внутри- и межвидовое взаимодействие;
-
прямой контакт между компонентами бактерий – такими, как липополисахариды, пептидогликаны;
- взаимодействие бактерий с рецепторами клеток макроорганизма;
- секрецию бактериальных компонентов, способных взаимодействовать с кишечным эпителием и модулинами, которые, в свою очередь, напрямую могут влиять на функцию клеток макроорганизма (на иммунный ответ, гликозилирование и т.д.) [36].
Защитные механизмы комменсальных микроорганизмов и пробиотиков
Эффект cross-talk зависит от возраста организма хозяина. У доношенного новорожденного ребенка достаточно развит врожденный иммунитет. Однако, для старта активного развития постнатального адаптивного иммунного ответа, лимфоидная ткань кишки должна быть простимулирована колонизирующей ее микрофлорой. Созревающая тонкая кишка новорожденного ребенка подвергается массивному воздействию большого количества колонизирующих бактерий, в то время как обычно бактерии колонизируют только дистальные отделы подвздошной, слепой и толстой кишки. Стимуляция GALT - системы новорожденного включает экспрессию интраэпителиальных лимфоцитов, расположенных над пейеровыми бляшками в подвздошной и толстой кишке. Эти клетки впоследствии обеспечивают cross-talk-взаимодействие между микроорганизмами и лимфоидными клетками [37].
Следовательно, раннее воздействие на тонкую кишку колонизирующей микрофлоры является важным этапом правильного созревания иммунной системы слизистой оболочки кишки.
Первостепенное значение для предотвращения развития иммунных защитных механизмов против комменсальной флоры имеет морфофункциональная зрелость энтероцита. Дети, рожденные до срока, предрасположены к развитию воспалительного процесса в кишке. В исследованиях показано, что по сравнению со взрослыми, интестинальные эпителиальные клетки плода характеризуются повышенной продукцией провоспалительных цитокинов не только в ответ на патогенные, но и на некоторые комменсальные бактерии [38, 39]. Также отмечено, что экспрессия TLR-4 типа (распознающего липополисахаридный компонент бактериальной стенки) в кишке снижается сразу после рождения у крысят, которые вскармливаются материнским молоком. Экспрессия TLR-4 типа, напротив, повышается, если крысята-сосунки подвергаются стрессу (например, гипоксии, введению чужеродного белка) [40]. К такой группе риска следует отнести и младенцев, рожденных раньше срока. Чаще всего это дети с признаками анте- и интранатального неблагополучия, не получающие молоко матери, а вскармливаемые молочной смесью. Приведенные факты свидетельствуют о том, что иммунный ответ организма, особенно у недоношенного новорожденного, может быть смещен в сторону развития воспаления.
Оценка адаптации пробиотиков in vivo является важным вопросом, так как функциональный вклад пробиотиков в экосистему макроорганизма связан в большей степени с их активностью, а не просто с присутствием. Кроме того, важно общее влияние пробиотиков на функциональное состояние кишечной микрофлоры без изменения ее видового состава.
В ряде работ показано, что пробиотики, например, Streptococcus thermophilus и L. Bulgaricus, влияют как на системный иммунный ответ, так и на иммунный ответ, ассоциированный с кишкой, через систему цитокинов [41]. Большинство иммунологических эффектов пробиотиков осуществляется в лимфоидной ткани тонкой кишки, в пейеровых бляшках. В связи с меньшей разницей в количестве пробиотических бактерий и бактерий-резидентов там пробиотики могут конкурировать с бактериями-резидентами в большей степени, чем в толстой кишке, в которой содержание индигенных бактерий велико. Таким образом, «перекрестная связь» между бактериями и тонкой кишкой может отличаться от таковой между пробиотиками и толстой кишкой.
Особый интерес представляют последние данные, касающиеся взаимодействия пробиотиов с toll-like рецепторами (TLRs). Сообщается, что распознавание комменсалов TLRs необходимо для поддержания кишечного гомеостаза, защиты эпителиальных клеток от повреждения и стимуляции их восстановления [42]. Используя in vitro линию эпителиальных клеток, удалось показать, что пробиотики (например, VSL#3) способствуют усилению барьерной функции благодаря TLR-2 типа, которые распознают пептидогликаны грамположительных бактерий [43, 44].
Существуют доказательства того, что различные клетки в кишке (эпителиальные и дендритные) на разных стадиях развития экспрессируют различные toll-like рецепторы. Например L. rhamnosus GG, способны предотвратить апоптоз, индуцируемый цитокинами, а L. reuteri - ингибировать активацию NF-?В, при этом М-клетки, выстилающие пейеровы бляшки, захватывают бактерии-пробиотики и представляют их дендритным клеткам. Эти данные подтверждаются in vivo обнаружением бактерий в лимфоидных фолликулах подвздошной кишки при исследовании биоптата [45, 46]. Таким образом, пробиотики способствуют укреплению барьерной функции кишки, предотвращению апоптоза эпителиальных клеток, значительному снижению захвата аллергенов, особенно в тонкой кишке.
Лактобациллы – хороший пример специфического иммунологического воздействия бактерий-пробиотиков. Являясь грамположительными бактериями, они экспрессируют лиганды для toll-like рецепторов, которые индуцируют иммунный ответ и способствуют тому, что эпителий и иммунокомпетентные клетки отличают патогены от индигенной флоры [47, 48].
Комменсальные бактерии, взаимодействуя с toll-like рецепторами дендритных клеток, индуцируют их созревание и выброс цитокинов, которые обеспечивают дифференцировку наивных Т-хелперов в клетки, способные обеспечить зрелый, сбалансированный Тh-клеточный ответ. Помимо этого, комменсальные бактерии могут пересекать клетки микроскладок и взаимодействовать с антиген-представляющими клетками в мезентериальных лимфатических узлах, активируя наивные плазматические клетки и превращая их в В клетки, продуцирующие секреторный IgA [49]. Секреторный IgA «покрывает» слизистую оболочку кишки, и, таким образом, контролирует микробную и антигенную пенетрацию. Имеются данные, свидетильствующие о том, что комменсальная микрофлора предотвращает развитие хронических воспалительных заболеваний гастроинтестинального тракта. Механизм защиты включает взаимодействие участка CpG ДНК бактерий - комменсалов и внутриклеточных TLR-9 типа, активацию Т регуляторных (T-reg) клеток путем продукции противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-? [4]. Комменсальные бактерии также способны продуцировать молекулы, которые поступают в интестинальные эпителиальные клетки и ингибируют активацию нуклеарного фактора транскрипции ?B. Затянувшееся воздействие молекулярных паттернов (петидогликанов и липополисахаридов), которые взаимодействуют с TLR-4 или TLR-2, может активизировать отрицательные внутриклеточные регуляторы и регуляторы поверхности клеток соответственно, которые, в свою очередь, могут выключать транскрипционные факторы, что приводит к снижению продукции воспалительных цитокинов и хемокинов [34]. В случае неадекватной первоначальной бактериальной колонизации для восстановления сблансированного иммунного ответа возможно использование пробиотиков [50].
К основным механизмам защиты макроорганизма, также относится иммунологическая и оральная толерантность. Особую роль в развитии оральной толерантности играет ранняя колонизация организм младенца, преимущественно комменсальными бактериями.
В исследовании, о развитии оральной толерантности у стерильных и колонизированных животных, которым орально вводили овальбумин (OVA), а затем сравнивали уровень специфического IgE для оценки гуморального ответа, было замечено, что оральная толерантность, проявляющаяся в снижении иммунного ответа с участием анти-OVA IgE, не может быть достигнута у стерильных животных [51]. Комменсальные бактерии, попадая в организм, стимулируют появление T-reg клеток, которые секретируют цитокины (IL-10, TGF-?), обладающие толерогенными свойствами и смягчающие активность иммунного ответа [52].
В дальнейших работах было показано, что для выработки такой толерантности важен уровень экспрессии TLR-4 типа на энтероците, который вызывается именно ранней колонизацией бактериями [53]. Массивная антибиотикотерапия уменьшает уровень колонизирующих бактерий и, таким образом, может нарушить развитие оральной толерантности [54]. Использование пробиотиков после антибиотиков способствует восстановлению толерантности [55].
Клиническое использование пробиотиков
Убедительные доказательства клинической эффективности использования различных пробиотиков при нарушении усвоения лактозы представлены в рандомизированных плацебоконтролируемых исследованиях и в мета-анализах. Достоверно установлено, что при использовании йогуртов, содержащих L. bulgaricus и S. thermophilus, улучшается перевариваемость лактозы [56, 57]; прием Saccharomyces Вoulardii и Lactobacillus (LGG, L. casei, L. bulgaricus) приводит к нормализации кишечного микробиоценоза при инфекционных гастроэнтеритах [58] и антибиотик-ассоциированных диареях [59].
Одной из новых сфер применения пробиотиков и пробиотических продуктов явилась профилактика острых респираторных инфекций (ОРИ) у детей.
Использование пробиотиков у детей, по данным рандомизированных клинических исследований, позволяет на 15–20% уменьшить общее число острых инфекционных заболеваний верхних и нижних дыхательных путей в зимний период [60, 61]. В этой связи наиболее изучены эффекты пробиотического штамма L. rhamnosus GG (ATCC 53103, LGG). Данный штамм обладает большинством характеристик, свойственных пробиотическим штаммам. Среди них: отличная выживаемость и транзитная колонизация ЖКТ, основой которых служит способность к адгезии к слизистой оболочке и эпителиальным клеткам кишечника [62].
Влияние L. rhamnosus GG на сокращение количества респираторных инфекций изучено в ряде научных центров. Так, в исследовании, участниками которого были здоровые дети, посещающие 18 детских садов г. Хельсинки (Финляндия), длительность наблюдения составила 7 месяцев. Все участники исследования (513 детей) случайным образом были разделены на две группы. В первой, основной группе, дети получали молоко, обогащенное L. rhamnosus GG (1–2 ?108 КОЕ/сут) 3 раза в день, в течение 5 дней в неделю; во второй, контрольной группе – стандартное молоко в аналогичном режиме. В исследовании отмечено, что дети, получавшие молоко, обогащенное L. rhamnosus GG, реже пропускали детский сад по болезни (4,9 против 5,8 дней на 1 ребенка; р=0,03), чем дети контрольной группы. И хотя родители не обнаружили существенных различий в проявлении симптомов респираторных заболеваний, само заболевание у детей первой группы протекало в более легкой форме и характеризовалось меньшим числом случаев осложнений инфекционного процесса (относительная разница между группами составила 17%). Детям, получавшим молоко, обогащенное L. rhamnosus GG, для лечения респираторной инфекции реже назначали антибактериальную терапию, чем второй второй группы (относительная разница между группами составила 19%) [60].
В педиатрической больнице Финляндии изучали роль L. rhamnosus GG в предотвращении нозокомиальных инфекций. В двойном слепом рандомизированном плацебоконтролируемом исследовании приняли участие 742 ребенка, разделенные на две группы: в 1-й группе дети получали 100 мл ферментированных молочных продуктов, содержащих L. rhamnosus GG 109 , во 2-й – такие же продукты, но без бактерии (плацебо). У детей 1-й группы частота возникновения желудочно-кишечных и респираторных инфекций была меньше по сравнению с группой сравнения [61].
Одно из рандомизированных плацебоконтролируемых исследований посвящено изучению влияния пробиотиков на снижение риска развития инфекций среди младенцев. В детских клиниках г. Хельсинки для наблюдения были отобраны младенцы до двухмесячного возраста, находящиеся на искусственном вскармливании. В рамках исследования, младенцам первой группы давали молочную детскую смесь, обогащенную L. rhamnosus GG и Bifidobacterium lactis Bb 12 (n=32), до достижения возраста 12 месяцев. Малыши второй группы получали обычную стандартную смесь (n=40). В течение первых 7 месяцев наблюдения острым отитом переболели 22% младенцев 1-й группы и 50% – 2-й (p=0,014); антибиотики прописывали 31 и 60% младенцев (p=0,015), соответственно. В течение первого года жизни, повторно переболели респираторными инфекциями 28% детей, принимавших молочную смесь с пробиотиками и 55% – получавших обычную смесь (p=0,022) [63].
Действие пробиотического комплекса, в состав которого входят L. rhamnosus GG, L. rhamnosus LC705, B. breve 99 и Propionibacterium shermanii ssp. freudenreichii JS, оценивали у детей, предрасположенных к отиту и аллергии. У детей, предрасположенных к отиту (n=309), пробиотический комплекс не смог предотвратить развития острого среднего отита и не повлиял на носоглоточное носительство патогенов. Однако в этой группе детей, отмечена тенденция к снижению частоты случаев повторных респираторных инфекций [64]. При анализе заболеваемости у младенцев, предрасположенных к аллергии, проведенном 2 года спустя, выяснилось, что при приеме того же пробиотического комплекса в сочетании с 0,8 г галактоолигосахарида респираторные инфекции регистрировали реже, чем в группе плацебо (3,7 и 4,2 раза, соответственно). Кроме того, в течение 6 месяцев наблюдения антибиотики в группе детей, принимавших симбиотический комплекс, назначали реже, чем детям в группе плацебо (23 против 28%) [65].
При проведении динамического иммунологического исследования у детей, поступивших в больницу вследствие острой диареи и обезвоживания, показано, что прием L. rhamnosus GG способствует индукции синтеза антител во время вирусной инфекции (анализ крови брали при поступлении, спустя 8 дней, а также через 3–4 недели после госпитализации). Это подтверждено результатами серологического анализа, который выявил существенное увеличение количества клеток, синтезирующих иммуноглобулины всех классов, а также более высокий уровень B-лимфоцитов, синтезирующих IgА против ротавирусного антигена. Увеличение количества антигенспецифических клеток, секретирующих IgА, обнаруживали через 3 недели после инфекции, а не в период острой фазы. Медленное формирование антигенспецифического ответа является важным механизмом в профилактике развития ротавирусной инфекции [65].
Отмечено, что сочетанное применение пробиотического штамма L. rhamnosus GG (ATCC 53103, LGG) и пероральной ротавирусной вакцины в течение 5 дней ускоряет ответ ротавирус-специфических и вакциноспецифических плазматических клеток, секретирующих IgМ у детей, принимавших L. rhamnosus GG, по сравнению с таковым в группе плацебо (р=0,02). Сероконверсия IgА происходила чаще в группе, принимавшей L. rhamnosus GG (р=0,05). Обнаружена тенденция к более высокому уровню IgА и IgG у участников исследования, принимавших L. rhamnosus GG в сочетании с вакцинацией (р=0,10) [67].
Таким образом, использование L. rhamnosus GG в составе пробиотических продуктов у детей сокращает количество случаев респираторных инфекций и уменьшает частоту осложнений. Следовательно, прием данных продуктов может быть хорошим профилактическим средством. Влияние L. rhamnosus GG в пробиотическом комплексе на респираторные инфекции менее очевидно, чем при приеме L. rhamnosus GG в составе пробиотического продукта. Для подтверждения результатов необходимы дополнительные исследования в сочетании с различными комплексами.
К числу современных высокоэффективных пробиотических продуктов относятся кисломолочные продукты торговой марки «Био Баланс» (ОАО «Компания ЮНИМИЛК», Россия), которые обогащены пробиотическим штаммом L. rhamnosus GG (ATCC 53103, LGG), культивированным в Финляндии компанией Валио. В линейку данных функциональных продуктов входят питьевые биойогурты, биокефиры (с массовой долей жирности 0%; 1% и 2,5%), творожки с мюсли, густые биойогурты, а также кисломолочный напиток Тан. С февраля 2010 г. уникальный пробиотик L. rhamnosus GG (ATCC 53103, LGG) входит в состав питьевых биойогуртов для детей раннего возраста торговой марки «Тёма» (ОАО «Компания ЮНИМИЛК», Россия). Это является подтверждением того, что развитие индустрии по созданию продуктов здорового питания пробиотического действия для различных возрастных групп населения стало важным и перспективным направлением в пищевой промышленности на ближайшие годы.
Учитывая доказанный профилактический эффект пробиотических продуктов при ОРИ у детей, можно ожидать, что их широкое использование будет содействовать снижению затрат, связанных с необходимостью лечения больного ребенка и ухода за ним, так как материальные затраты государства на 1 случай ОРИ составляют в среднем 1115 руб., а общий ущерб экономики России только в период эпидемии гриппа находится на уровне 50 млрд руб. и более [68].
Заключение
Терапевтический потенциал пробиотиков в настоящее время, является доказанным. Он связан с комплексным воздействием пробиотиков на макроорганизм: повышением колонизационной резистентности кишечника, снижением воспалительной направленности процессов, улучшением состояния общего и местного иммунного ответов. Эти данные служат основанием для расширения клинического использования пробиотиков с лечебной и профилактической целью.
|
